Kazuhide Asakawa

2020年の終わりに

今年のはじめ、2月の末に、光遺伝学ALSモデルに関する論文を発表することができました。2月の末といえば、コロナウイルスが決して侮れない、気をつけなくてはならないウイルスである、という意識が世間に広がりつつあり、論文の余韻に浸るまもなく、時代が変わってしまった感じでした。

今年の書き初めは「自然との対話」で、自然と真摯に向かい合い、耳を傾けることを目標にしました。振り返ってみると、自然とは、コロナウイルスであったように感じます。幸い、ウイルスには感染することなく、過ごせました。

これまで、不連続な大きな時代の変化は経験したことはありませんでした。今年はそれです。時代は突然に変わることはあるのだなと。

ラボにいけない時は、総説、その他を三編書きました。結構大変でしたが、実りある時間でした。残りは2021年に出版されることでしょう。

論文は、コロナウイルスでどこかに飛んで行ってしまったような感じがしましたが、stay-at-home期間に頭を捻って地道に書いた申請は、いくつかが受理され、2021年につながったと思います。光遺伝学ALSモデルの発展を支えてくれた「せりか基金」賞を再び頂くことができました。また、今年の後半になると、論文を読んでくださった方が、声をかけてくれることが増えました。

2021年は、粘り強く、この流れを大切にしたいと思います。

光遺伝学でALSの謎を照らす（６）

（５）からのつづき

全身の筋肉が衰える難病、筋萎縮性側索硬化症（きんいしゅくせいそくさくこうかしょう、ALS）では、筋肉の伸び縮みのコントロールや、筋肉への栄養補給を担当している神経細胞「運動ニューロン」が、失われます。多くのALSでは、形や機能が失われていく（変性する）運動ニューロンに、TDP-43（ティーディーピー４３）と呼ばれるタンパク質の塊が溜まることが知られています。

前回の「光遺伝学でALSの謎を照らす（５）」では、体がほぼ透明な熱帯魚ゼブラフィッシュの稚魚を研究材料に使えば、生きた動物の体内の運動ニューロンの内部まで詳しく観察できることを説明しました。この運動ニューロンに、青い光を吸収すると塊をつくるように細工を加えたTDP-43（オプトTDP-43）を導入し、青い光を照射すれば、オプトTDP-43が塊を形成し、ALSの運動ニューロンのようなTDP-43の塊が再現されるのでしょうか？

この実験をする前の予想は、オプトTDP-43は塊を形成するけれども、ALSのような状態にはならないのではないか、というものでした。なぜならば、TDP-43は、健康な状態では、遺伝情報か入っている細胞核（さいぼうかく）という球形の膜の中に豊富にあるので、青い光を照射すれば、細胞核の中で塊を形成するだろう、と（図）。一方で、ALSの運動ニューロンで、TDP-43の塊が溜まるのは、細胞核の外側の、細胞質（さいぼうしつ）という区画です。ALSの状態を忠実に再現するには、細胞質にだけ青い光を照射するという高度な技術がさらに必要になるだろうと予想していました。

ところが、実際に得られた結果は、この予想に反していました。運動ニューロン全体に青い光を照射すると、細胞核に豊富あったオプトTDP-43は、数時間後には細胞全体に広がり始めました。さらに、数日間、青い光の照射をつづけると、細胞質にオプトTDP-43の塊が溜まることがわかりました。細胞核の中にあったTDP-43が、細胞質で塊をつくる、というあたかもALSで想定されているような現象が再現されました。

なぜ、細胞核に豊富にあったオプトTDP-43が、細胞質で塊をつくることができるのか？これは、今ある知識だけでは説明は難しいです。ここに、まだ知られていないTDP-43の性質が隠されているはずです。

この実験でやった操作は、青い光を照射してオプトTDP-43のCRY2の部分をつなぎ合わせることだけです。ということは、一つには、TDP-43分子同士がどのように結合しているかが、細胞内の分布（細胞核か細胞質のどちらにいるのか）に、とても大切な意味を持っていることが予想されます。この予想が正しければ、ALSの運動ニューロンで、細胞質にTDP-43の塊が溜まるのは、TDP-43同士の結合の仕方が変わるからである可能性があります。

さて、この予想外に興味深い結果に至る前に、私たちは、ゼブラフィッシュの筋肉細胞や体表を覆う上皮細胞を使って実験をしていました。これらのタイプの細胞は、サイズが大きいので、オプトTDP-43の変化を捉えやすいと考えたからです。しかし、これらの細胞では、青い光を照射しても、オプトTDP-43は細胞核に留まったまま、一向に変化を示しませんでした。ダメ元で、運動ニューロンでやってみて、ダメならこのオプトTDP-43のプロジェクトはもう止めましょう、という最後の一回で、オプトTDP-43の細胞質への移行が確認できました。スレスレで、やめないですみました。

この結果は、実は、運動ニューロンという細胞が、他のタイプの細胞よりも、TDP-43を細胞質に溜めやすい性質をもっていることを暗示しています。ALSでは、なぜか運動ニューロンだけ変性する、という不思議な現象の謎を解く上で、大切な知見かもしれません。

この実験で、TDP-43の塊の細胞質での蓄積を、光を使ってコントロールできることがわかりました。今までにない新しい実験法なので、TDP-43の新しい性質を明らかに出来るに違いありません。

光遺伝学でALSの謎を照らす（７）へつづく

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今年の初めに発表した光遺伝学ALSモデル（Asakawa, 2020）について、まとめとこれからの展望をPerspective記事としてNRR誌に発表しました。記事をもとに、説明を付け加えて和訳しました。

【出典】

Do not curse the darkness of the spinal cord, light TDP-43.　Asakawa K, Handa H, Kawakami K (2021) Neural Regen Res 16(5):986-987.

光遺伝学でALSの謎を照らす（５）

（４）からのつづき

私たちの体には、およそ600種類の筋肉があるといわれています。

体の動きは、この多くの筋肉の伸び縮みの組み合わせによって生まれます。まず、脳が、筋肉の組み合わせと、伸び縮みのタイミングの指令を発し、いくつかの神経細胞のリレーによって、筋肉に指令が伝えられます。最終的に筋肉に指令を手渡す神経細胞は「運動ニューロン」とよばれています。

運動ニューロンは、背骨の中を通っている脊髄（せきずい）に並んでいて、そこから束になった長いケーブルを伸ばして、筋肉に接続します。この運動ニューロンの束を運動神経（うんどうしんけい）と呼びます。「あの子は、運動神経がいいねぇ」という時に、このケーブル組織を思い浮かべている人は、きっとただ者ではないでしょう。

例えば、指を動かす筋肉に接続する運動ニューロンは、脊髄の肩ぐらいの高さの位置で、脳からのシグナルを受け取って、ケーブルを介して指の筋肉の動きをコントロールしています。このような機能を発揮するために、運動ニューロンは、細長くて、大きくて、複雑な形をしています。

運動ニューロンが形や機能を徐々に失う（変性する）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）とよばれる病気では、運動ニューロンが変性する原因が未だ明らかになっていません。ALSの原因の究明を難しくしている要因の一つとして、運動ニューロンが観察しにくく、研究が難しいことが挙げられます。

前回のブログで、ALSの運動ニューロンに塊をつくって溜まるTDP-43というタンパク質について触れました。TDP-43に細工を加えて、青い光を吸収すると集合して塊を作るTDP-43（オプトTDP-43）が開発されました（光ドロップ法）。シャーレの中の細胞にオプトTDP-43を導入して、細胞に青い光を照射すると、オプトTDP-43が集合して塊を形成します。この過程のどこかで、細胞に損傷を与えることわかりました。体内の運動ニューロンにも、オプトTDP-43は、同じように損傷を与えるのでしょうか？

この問題の検証は、ALSの原因を探る上で大切ですが、運動ニューロンが観察しにくいことが大きなハードルになっています。

このハードルは、ゼブラフィッシュという名の熱帯魚を使うことで、下げることができます。魚は、人間と同じ脊椎（せきつい）動物で、背骨があり、その中に脊髄が通っています。この脊髄の中には、人間と同じように、運動ニューロンが並んでいて、そこからケーブルを伸ばして筋肉と接続しています。ゼブラフィッシュの成魚は、体長が４センチほどですが、稚魚は３〜４ミリで、体の組織が透明なので、魚を生かしたまま運動ニューロンを観察することができます。

実際には、透明度があまりに高いために、稚魚の中の運動ニューロンを染色しないかぎりは、観察することは難しいです。私たちは、これまでの研究で、運動ニューロンの中にいろいろなタンパク質を導入する方法を開発してきました（Asakawa 2013）。写真は、運動ニューロンに緑色蛍光を発するタンパク質を導入した魚ですが、脊髄の中にある細胞体（さいぼうたい）から、細長いケーブルが伸びて、筋肉と接続部位（シナプス）まで、運動ニューロンの全体がハッキリと観察できます。

では、このゼブラフィッシュの運動ニューロンに、オプトTDP-43を導入して、青い光を照射すると、運動ニューロンはどうなるのでしょうか？ ALSと似た状態になるのでしょうか？

光遺伝学でALSの謎を照らす（６）へつづく

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【出典】

Do not curse the darkness of the spinal cord, light TDP-43.　Asakawa K, Handa H, Kawakami K (2021) Neural Regen Res 16(5):986-987.

光遺伝学でALSの謎を照らす（４）

（３）からのつづき

神経細胞の形や機能がだんだんと失われる病気、神経変性疾患では、神経細胞に異常なタンパク質の塊が溜まることが多いです。この異常なタンパク質の塊は、長い時間をかけてできあがると考えられていて、これを実験で再現するのは、容易ではありません。その為、どのように異常な塊が作られるのか？あるいは、その塊は細胞にとって良いものなのか、悪いものなのか？など、基本的で大切な問題の理解が遅れています。

この問題を解く方法として、最近、optoDroplet法（ここでは、光ドロップ法と訳します）が発明されました。この技術は、植物が備えている光を感じる力を利用します。

このブログを書いている今は12月中旬、もうすぐクリスマスですが、例えば、ポインセチアが赤くなるのは日の当たる時間が短くなるからで、植物が光に反応している証拠です。話を戻しますと、シロイヌナズナという植物にあるクリプトクローム２（以下、CRY2と記します）というタンパク質は、青い光を吸収すると自分自身と結合して、２つのCRY2分子が結合した状態になります。このCRY2の性質によって、光環境に対処するために必要な遺伝子群が働き始め、シロイヌナズナは、花芽を作ったり、成長したりしています。さらに、CRY2分子の一部を切り取ると、CRY2分子が２つではなく、いくつも集合して塊を形成します。このCRY2の集合能力を利用して、タンパク質を集合させて塊をつくる技術が光ドロップ法です。集合させたいタンパク質にCRY2を付けておけば、光を吸収してCRY2が塊をつくるついでに、目的のタンパク質も塊をつくるだろう、というアイデアです。光ドロップ法が登場する前は、病気に関わるタンパク質の塊は、細胞の中のタンパク質濃度を上昇させることで、作ることができました。しかし、多くの場合、タンパク質の濃度が上昇すると、それ自体が細胞に悪影響を及ぼすことがあり、結果としては、タンパク質の塊の細胞への影響を正確に評価することが困難でした。

筋肉の収縮をコントロールする神経細胞「運動ニューロン」が変性する筋萎縮性側索硬化症（ALS）では、TDP-43と呼ばれるタンパク質の異常な塊が蓄積することが多いことが知られています。光ドロップ法をTDP-43に応用する為に、TDP-43とCRY2を融合させたタンパク質、オプトTDP-43が開発されました（図）。シャーレの中で培養された細胞の中でオプトTDP-43作らせて、細胞に青い光を照射すると、オプトTDP-43のCRY2の部分の集合がきっかけとなって、オプトTDP-43が徐々に塊をつくることがわかりました。このような細胞は、死滅する確率が格段に上昇することから、TDP-43の塊をつくる過程のどこかで、細胞がダメージを受けることがわかりました。すなわち、TDP-43が塊を形成することは、細胞に毒性をもたらすというわけです。

これが、実際にALSで起こっていることと、どのくらい似ているのか？

この問いを検証する為には、生体の中の「運動ニューロン」の中で同様の実験をして確かめるのが理想です。人体の「運動ニューロン」では、実験は無理ですから、体の奥深くにある運動ニューロンに光が到達しやすいモデル動物を選ぶ必要があります。

光遺伝学でALSの謎を照らす（５）へつづく

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【出典】

Do not curse the darkness of the spinal cord, light TDP-43.　Asakawa K, Handa H, Kawakami K (2021) Neural Regen Res 16(5):986-987.

光遺伝学でALSの謎を照らす（３）

（２）からのつづき

ALSで変性する神経細胞「運動ニューロン」には、TDP-43というタンパク質が塊となって溜まるケースが多いことが知られています。TDP-43は、414個のアミノ酸が数珠つなぎになってできています。タンパク質を作るのに使われるアミノ酸は、20種類ですが、この20種類をどの順番で414個並べるかは、ランダムではなく、TDP-43の情報を含んでいる遺伝子にきっちり記されています。

アミノ酸には、大きい、小さい、プラスやマイナスの電荷をもっている、水分子と馴染みやすい、など様々な個性があります。この個性の並び方によって、TDP-43の分子の形や働きが決まってきます。

これまでにわかってきたことは、414個のうち、はじめの100個ぐらいのアミノ酸の領域（図、濃いオレンジ）は、TDP-43同士がお互いに結合する為に使われています。また、この領域のプラスの電荷をもったアミノ酸の働きによって、TDP-43が細胞核の中に輸送されることもわかっています。

真ん中の領域（図、薄いオレンジ）は、核酸と呼ばれる物質（RNA）と結合します。TDP-43の大切な働きは、人間では２万種類ある遺伝子のうちの、6,000の遺伝子から、それぞれタンパク質が作られるのを助けることです。その為に、この真ん中の領域は欠かせません。

最後の140アミノ酸（図、赤い領域）は、天然変性領域（てんねんへんせいりょういき）と呼ばれていて、カチッときまった形を持たないで柔軟に形を変化させると予想されています。遺伝するタイプのALSの中には、TDP-43の変異が原因となっていることが稀にありますが、その変異はこの天然変性領域に集中しています。このことから、天然変性領域の性質が変化して、TDP-43が異常な塊をつくることが、ALSの原因になっているのではないか、と一説には予想されてきました。

この予想を検証する為には、実験で天然変性領域の性質を変えてTDP-43の塊を形成させることで、運動ニューロンが変性するのか否か、を検証しなくてはなりませんが、TDP-43の塊を再現するのは、とても難しく、この予想は検証されていませんでした。

しかし、2017年に、植物に含まれている青い光を吸収すると塊をつくるタンパク質を利用して、天然変性領域の塊を作らせる技術が開発されると、この予想を検証する道が拓かれはじめました。

光遺伝学でALSの謎を照らす（４）につづく

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【出典】

Do not curse the darkness of the spinal cord, light TDP-43.　Asakawa K, Handa H, Kawakami K (2021) Neural Regen Res 16(5):986-987.

光遺伝学でALSの謎を照らす（２）

（１）からのつづき

＜本文＞

ALSは、筋肉の伸び縮みをコントロールする神経細胞「運動ニューロン」が、徐々に変性する神経の難病です。

運動ニューロンには、背骨の中をとおっている脊髄（せきずい）と筋肉を連結する「下位（かい）運動ニューロン」と、下位運動ニューロンに連結する脳の神経細胞「上位（じょうい）運動ニューロン」があり、ALSではこの両方が変性します。運動ニューロンが変性して筋肉の衰えが進むと、やがては身体を動かすことができなくなります。

9割以上のALSは遺伝しないタイプで、「孤発性（こはつせい）ALS」と呼ばれます。孤発性ALSでは、運動ニューロンにTDP-43と呼ばれるタンパク質が異常な塊として溜まることが知られています。残りの1割は、「家族性ALS」と呼ばれる遺伝するタイプです。家族性ALSのうちの4％では、TDP-43の変異が受け継がれていることが知られています。このことから、TDP-43の変異が原因で、ALSがおこりうることがわかります。しかし、孤発性ALS にはTDP-43の変異がみつからないので、TDP-43変異によっておこる家族性ALSと、孤発性ALSが同じ仕組みでおこるのか、現時点ではわかっていません。

では、TDP-43とは一体何でしょう？

TDP-43は、線虫からヒトまで多くの生き物の体のなかで共通して働いているタンパク質です。例えば、人間の体の中には2万種類の遺伝子があって、それぞれから異なったタンパク質が作られています。TDP-43は、この2万種類のうちの6,000のタンパク質を作りだすために働いていると考えられています。2万種類のタンパク質の設計図ともいうべき遺伝子情報（ゲノム）は、DNAと呼ばれる物質に書き込まれていて、細胞の中では、細胞核（さいぼうかく）とよばれる膜で囲まれた球形の区画に折り畳まれて収納されています（図、左）。健康な細胞では、TDP-43は細胞核に豊富に含まれていて、設計図を書き出してタンパク質を作り出す働きをしています。

ところが、ALSの運動ニューロンでは、TDP-43は細胞核の外に出て、細胞質（さいぼうしつ）と呼ばれる区画で異常な塊になっています（図、右）。健康な時にはTDP-43は細胞核に豊富に含まれていたのに、なぜ、ALSでは細胞質にあるのでしょうか？このTDP-43におこる変化を、人体で観察するよい方法は今のところありません。

この謎を解く為には、まず、健康な細胞でTDP-43がどのように働いているのか？について理解しなくてはなりません。これまでの研究から、TDP-43が以下のような性質を持っていることが明らかになっています。

１）TDP-43は細胞核に豊富だが、細胞核と細胞質を行ったり来たりしている

２）いくつかのTDP-43分子が集まることで、TDP-43としての機能がうまれる

３）TDP-43は、細胞質でどんどん分解されている

一般に、タンパク質は、アミノ酸が数珠つなぎになって作られます。タンパク質の材料となるアミノ酸は20 種類あって、アミノ酸をどの順番でいくつつなげるかがDNAの設計図に記されています。TDP-43は、414個のアミノ酸がつながってできています。どうやら、上にあげた3つTDP-43の性質は、414個のアミノ酸の中でも、先頭の100個のアミノ酸のつながりを上手に使うことで生まれている、という証拠が集まってきています。

100個のアミノ酸という小さな領域を、どのように使ったら、このような多彩な性質が生まれるのか、という問題は、現在の最先端の研究課題です。

光遺伝学でALSの謎を照らす（３）につづく

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【出典】

Do not curse the darkness of the spinal cord, light TDP-43.　Asakawa K, Handa H, Kawakami K (2021) Neural Regen Res 16(5):986-987.